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生物催化是利用微生物代谢过程中产生的酶催化合≡成各种新的化合物和天然产物的过程。由于生物催化反应简单易行和高效的特点，近来十多年，生物催化剂在有机合成中应用的数量快速的增加，特别是对于手性化合物的合成。在它们中间，醇脱氢酶（alcohol dehydrogenases，ADH，EC1.1.1.1）成◎为了焦点，它是一种氧化还原酶，在催化反应中具有很高的立体和区域选择性，能催化还原一系列潜手性的酮酯转化为相应的⊙手性醇，而后者是合╱成药物，农用化学品，芳香剂的重要手性砌块。 在生物〒催化反应中，使用游离的酶作生物催化剂，反应活性很高，但是反应产物提取和分离的过程复杂。而通过固定化后，酶的稳定性提高，产物易于分离，并且还可以反复使用，降低了生产成本。因此，近年来在生物技术中固定化成为了研究热点。 固定化酶的方法很多，常用的有吸附法，共价结↘合法，包埋法；所用的材料包括了合成的有机聚合物，生物高分子聚合物，无机材料等。为了克服有机材料机械强度低，稳定性差的不足，本文在参考文献的基础上，从透性化啤酒酵母细胞中提取醇脱氢酶，采用●共价结合法，以衍生化的无机材料凹凸棒作为载体，固定化醇脱氢酶。 选择凹凸棒（attapulgite，ATP）作为载体，利用了凹凸棒具有抗酸性，热力学稳定性和较高的机械强度的性能，来达到提高酶的pH，热力学，操作和反复使用的稳定性的目的。本文选择了乙酰乙酸乙酯作为模型底物，用固定化醇脱氢酶作为生物催化剂，催化不对称还原乙酰乙酸乙酯（ethyl acetoacetate，EOB）为S型的3-羟基-丁酸乙酯（ethyl（S）-3-hydroxy butyrate，（S）-EOB）；主要对透性化啤酒酵母提取醇脱氢酶的影响因素，固定化醇脱氢酶以及催化不对称合成S型3-羟基-丁酸乙酯的条件进行了研究；并且以游离和固定化醇脱氢酶的活性，不对称还原反应的产物的产率、对应体过量值ee（enantiomeric excess）为指标，考察了分离提取的醇脱氢酶和固定化醇脱氢酶的稳定性，及其他因素对催化合成的影响。对透性化Ψ 啤酒酵母中提取ADH的影响因素及提取的ADH稳定性进行了研究 实验结果表明，分离提取醇脱氢酶的过程中，细⊙胞量与缓冲液的比（W：v）5：20，在5℃，pH7.5磷酸缓冲液中超声破碎细胞，加入的硫酸铵为35％，所提取的ADH酶的活性最高达到105U/ml。稳定性实验表明，ADH粗提液的最适pH和温度分别为7.0，25℃。通过红外检测，用氨基硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对凹凸棒进行衍生化处理，得到了硅烷衍生化的凹凸棒。 而制备固定化ADH中，最佳条件为：戊二醛的浓度0.5％，固定化温度30℃，pH6.8。最后得到的固定化ADH酶的活性最高可以达到0.074U/mg。固定化ADH的稳定性实验表明，与游离的ADH相比，固定化后ADH稳定性有明显提高，它的最适温度与pH值分别为35℃，pH7.5；在水浴中震摇32h，仍热保持原有活性的58％。 催化不对称合成◣实验表明，在0.1M pH7.0的磷酸缓冲液中，反应2个小时，产物产率可以达到88％，（S）-EHB的ee达到99.2％，固定化的ADH，经8次循环使用后，活性仍ζ保留42％。

    关键词：
    醇脱氢酶 分离提取 凹凸棒ω载体 手性合成 生物催化剂 固定化ADH
    作者：
    赵泉
    学位授予单位：
    重庆医科大学
    授予学位：
    硕士
    学科专业：
    生物制药与生物医用材料
    导师姓名：
    于明安
    学位年度：
    2009
    语种：
    中文
    分类号：
    Q554.9
    在线出版ω　日期：
    2009年12月25日